使用 DIANN 在 Linux 上进行 DIA 质谱数据分析流程

本项目提供了一个标准化的、可复现的工作流程，用于在 Linux 系统 (包括 WSL) 上使用 DIANN 软件分析数据非依赖采集 (DIA) 的质谱数据。

该流程的核心优势在于：

• 环境隔离: 所有软件依赖（DIANN, .NET）均通过 Conda 环境管理，与主系统完全隔离，保证了极高的可复现性。
• 智能自动化: 核心脚本能自动检查并生成谱图库，避免重复工作，确保分析一致性。
• 健壮性: 脚本包含路径和文件检查，能提前发现并报告常见错误。

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目录

1. 环境要求与设置
2. 数据准备与项目克隆
3. 执行分析
4. 结果文件说明
5. 常见问题

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1. 环境要求与设置 (Environment Setup)

本流程的所有依赖项都通过 Conda 进行管理。以下步骤将指导您如何在您已有或新建的 Conda 环境中安装所有必需的软件。

步骤 1: 准备并激活 Conda 环境

首先，请确保您已有一个 Conda 环境，并将其激活。如果您没有，可以按以下方式创建一个：

# (可选) 如果您没有环境，可以创建一个新的
# conda create --name bioinfo python=3.10 -y

# 激活您的目标环境 (将 bioinfo 替换为您的环境名)
conda activate bioinfo

步骤 2: 在激活的环境中安装 DIANN 及其依赖

在已激活的 Conda 环境中，按顺序执行以下命令。

A. 安装 .NET 8.0 SDK (DIANN 必需依赖)

DIANN 需要 .NET 8.0 或更高版本来读取 Thermo .raw 文件。

# 下载并运行微软官方安装脚本，将其安装到当前 Conda 环境中
wget https://dot.net/v1/dotnet-install.sh -O dotnet-install.sh
chmod +x ./dotnet-install.sh
# --channel 8.0 会自动安装 8.0 系列的最新稳定版
./dotnet-install.sh --channel 8.0 --install-dir $CONDA_PREFIX
rm dotnet-install.sh

注意：以上命令安装的是完整的SDK，它包含了Runtime，并能确保所有 dotnet 验证命令正常工作。

B. 安装 DIANN

由于 DIANN 没有官方 Conda 包，我们将其程序文件直接安装到当前环境中。

# 1. 在临时目录下载并解压 DIANN (请从官网确认最新版本链接)
mkdir -p ~/diann_temp_download
cd ~/diann_temp_download
wget https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/download/2.0/DIA-NN-2.1.0-Academia-Linux.zip
unzip DIA-NN-2.1.0-Academia-Linux.zip

# 2. 将 DIANN 程序文件夹移动到当前 Conda 环境的 opt/ 目录下
mkdir -p $CONDA_PREFIX/opt
mv diann-2.1.0 $CONDA_PREFIX/opt/

# 3. 赋予执行权限并创建符号链接
chmod +x $CONDA_PREFIX/opt/diann-2.1.0/diann-linux
ln -s $CONDA_PREFIX/opt/diann-2.1.0/diann-linux $CONDA_PREFIX/bin/diann

# 4. 清理临时下载目录
cd ~
rm -rf ~/diann_temp_download

步骤 3: 验证安装

在已激活的 Conda 环境中，运行以下命令进行验证：

dotnet --version
# 期望输出: 8.0.x

diann --version
# 期望输出: DIANN 2.1.0 ...

如果两条命令都成功返回版本信息，您的分析环境就已经完美配置！

2. 数据准备与项目克隆 (Data Preparation & Project Clone)

步骤 1: 克隆本项目

git clone https://github.com/Jasper-delong/DIANN_workflow.git
cd DIANN_workflow

步骤 2: 下载蛋白质数据库 (FASTA)

本项目要求将 FASTA 数据库下载到项目内的 data/fasta/ 目录中。.gitignore 文件已配置好，会忽略此目录下的所有文件。

# 定义将要保存FASTA文件的目录和文件名
FASTA_DIR="./data/fasta"
FASTA_FILENAME="uniprot-human-swissprot-$(date +%Y-%m-%d).fasta"

# 下载并解压
echo "--- 正在从 UniProt 下载人类参考蛋白质组到 ${FASTA_DIR} ---"
wget -O "${FASTA_DIR}/${FASTA_FILENAME}.gz" "https://rest.uniprot.org/uniprotkb/stream?compressed=true&download=true&format=fasta&query=%28reviewed%3Atrue%29+AND+%28model_organism%3A9606%29"

echo "--- 下载完成，正在解压... ---"
gunzip "${FASTA_DIR}/${FASTA_FILENAME}.gz"

echo "--- 数据库准备就绪，存放于: ${FASTA_DIR}/${FASTA_FILENAME} ---"

步骤 3: 定位你的原始数据

将你的质谱原始文件 (如 .raw 或 .d 文件) 存放在你电脑的任何位置 (例如 /mnt/d/my_dia_data)。重要: 请勿将大型原始数据文件放入本项目文件夹内。

3. 执行分析 (Running the Analysis)

本项目的核心 run_diann.sh 脚本实现了一个智能化的两步法分析工作流：

1. 阶段一 (自动): 脚本会首先检查一个项目专属的理论预测谱图库是否存在。如果不存在，它会自动调用 DIANN，根据您提供的 FASTA 文件和预设的酶切参数（Trypsin/P, 1个漏切位点）来生成这个谱图库。
2. 阶段二 (自动): 一旦谱图库准备就绪，脚本会立即使用这个库来分析您指定的文件夹中的所有原始数据文件，并生成最终的定量报告。

Note

这个设计的最大优势在于效率和一致性。您只需在第一次运行时花费时间生成谱图库，后续的所有分析（即使添加或删除原始数据文件）都会重用同一个谱图库，既节省了时间，又保证了结果的可比性。

步骤 1: 配置运行脚本

Important

每次分析前，请务必打开 scripts/run_diann.sh 文件，并根据你的实际情况修改顶部的 用户配置区。 如果要使用，只有“用户配置区”这里可以修改，用作寻找路径。如果原始文件是.d文件，请在“【核心】准备文件参数列表”这里进行修改，修改方式在脚本文件中已写明

您需要修改的核心变量包括 RAW_FILE_DIR (原始数据文件夹路径) 和 FASTA_FILENAME (FASTA文件名)，并确认脚本中用于查找文件的后缀 (默认为 *.raw) 与您的实际文件类型是否匹配。

步骤 2: 执行分析

1. 赋予脚本执行权限 (首次运行时必需):

   chmod +x scripts/run_diann.sh

2. 运行完整的分析流程:

   bash scripts/run_diann.sh

   脚本将自动开始执行。如果需要，它会先进行耗时较长的谱图库生成，然后进行最终的定量分析。所有日志都会实时打印在终端上。

4. 结果文件说明 (Outputs)

分析成功后，results/ 文件夹中会包含多个文件。最重要的文件是：

• project_library.tsv: 第一次运行时，根据你的数据和FASTA文件生成的项目专属实验谱图库。后续分析会重复使用此库以保证一致性。

• report.tsv: 主要结果文件。这是一个表格文件，包含了每个前体、肽段和蛋白质在所有样本中的定量信息。这是所有下游统计分析的起点。

• report.stats.tsv: 包含运行统计信息。

5. 常见问题 (FAQ)

Q: 分析速度很慢怎么办?

A: 在 scripts/run_diann.sh 脚本的 用户配置区，增加 THREADS 的值，使其接近你电脑的 CPU 核心数。

Q: 如何重新生成谱图库?

A: 只需手动删除 results/project_library.tsv 这个文件，然后重新运行 bash scripts/run_diann.sh 即可。脚本会自动检测到库文件不存在并重新生成。

Q: 脚本报错说找不到原始文件怎么办?

A: 请检查 run_diann.sh 中的 RAW_FILE_DIR 路径是否为正确的绝对路径，并确认脚本中用于查找文件的后缀（默认为 *.raw）与你的实际文件类型是否匹配。

如何贡献

欢迎通过 Pull Requests 或 Issues 对本流程提出改进建议。

许可证

本项目采用 MIT License。